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细胞自噬与病毒感染

发布时间:2020-09-21 11:46:39 | 来源:【药物研发团队 2020-9-21】
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细胞自噬从被发现,到2016年大隅良典因其获得诺贝尔奖至今,一直都是细胞分子领域的研究热点,近些年细胞自噬相关的文章大量涌现,细胞自噬的多种生理功能被挖掘,其中在机体免疫方面的自噬的功能一直备受关注,研究表明自噬在机体免疫系统,包括免疫防御、免疫监视、免疫自身稳定方面均存在重要的意义。自噬作为“降解”的一种途径,可以将大分子物质分解成可被再利用的小分子物质;或将已损坏或有害的物质清除以维持自身的稳态,同时也是细胞重要的防御机制,面对病毒寄生的威胁,自噬拥有将寄生在宿主细胞内的病毒的蛋白质、核酸以及组装好的病毒颗粒包裹运送至溶酶体的能力,这为自噬在抗病毒免疫中的作用奠定了重要基础。虽然目前对于自噬参与抗病毒免疫的机制仍未完全了解,但已有相关实验证明自噬参与病毒免疫,研究人员利用果蝇模型,发现炎性依赖的干扰素刺激因子(Sting)活化可以诱导抗病毒自噬限制寨卡病毒在果蝇大脑中的感染,这验证了自噬在病毒固有免疫方面的功能,同时自噬和干扰素协同作用也可以促进病毒的清除,自噬在细胞因子的调控中发挥双重作用也成为一个新兴的研究课题。此外,自噬可被Tall样受体(TLR)信号诱导清除细胞内病原体,协助吞噬细胞非特异性吞噬病毒,参与病毒抗原的加工提呈,同时自噬也参与了记忆型免疫细胞的形成和寿命的长期维持,应对病毒的持续感染或二次感染。

细胞自噬是真核生物进化上高度保守的生命现象,是一种通过清除和重新利用生物大分子和损坏的细胞器的方式来维持细胞稳态的内膜运输过程。细胞自噬是一种保护性机制,使细胞在适应外界环境受到多重刺激时得以存活。越来越多的研究表明病毒感染与细胞自噬关系密切,一些病毒感染细胞后将会引发细胞自噬,或是影响自噬的通路,从而影响细胞的存活与病毒自身的复制。因此,对病毒、病毒感染、细胞自噬及其相互作用关系进行深入研究,对于防治病毒感染具有极其重要的意义。

一、病毒

病毒是一种个体微小、结构简单,只含一种核酸(DNA或RNA),必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖、并可以在其它生物体间传播并感染生物体的非细胞型微小物体。

由于病毒本身不能进行新陈代谢,不具有生命力,如果不感染宿主病毒就不能复制繁殖,所以从某种程度上来说,病毒不是一种生物。有时使用“病毒”描述那些在真核生物中传播和感染的生物;使用“噬菌体”或“吞噬体”来描述那些在原核生物间传播的生物。目前,病毒的起源还不清楚。

病毒是一种非细胞生命形态,它由一个核酸长链和蛋白质外壳构成,病毒没有自己的代谢机构,没有酶系统。因此病毒离开了宿主细胞,就成了没有任何生命活动、也不能独立自我繁殖的化学物质。它的复制、转录、和转译的能力都是在宿主细胞中进行,当它进入宿主细胞后,它就可以利用细胞中的物质和能量完成生命活动,按照它自己的核酸所包含的遗传信息产生和它一样的新一代病毒。

狭义的生物病毒是一种独特的传染因子,它是能够利用宿主细胞的营养物质来自主地复制自身的DNA或RNA、蛋白质等生命组成物质的微小生命体。而广义的病毒复杂得多,包括拟病毒、类病毒和病毒颗粒,其中拟病毒和类病毒仅是一条简单的ssRNA链,病毒颗粒是一种类似酶的蛋白分子。因此生物病毒很难有一个确定的、明确的定义。

生物病毒不管是烈性噬菌体还是温和型噬菌体,都必需在活的宿主细胞中才能得以复制繁殖,利用宿主细胞的核苷酸和氨基酸来自主地合成自身的一些组件,装配下一代个体,并达到他们的目的。复制后的生物病毒裂解宿主细胞而被释放出去,感染新的宿主细胞。

虽然有些生物病毒会给人类带来一定的益处,例如利用噬菌体可以治疗一些细菌感染;利用昆虫病毒可以治疗、预防一些农业病虫害等,但大部分病毒的危害很大,例如HIV、狂犬病毒等,给人类带来生命的危险;流感病毒、肝炎病毒等会带来疾病;一些冠状病毒可以引发重大公共卫生事件和重大疫情。

病毒的基本结构

病毒由蛋白质外壳和内部的遗传物质两部分组成,其内部的遗传物质是核酸,核酸外面由蛋白质外壳包裹,是一种没有细胞结构的特殊生物,其结构非常简单,不能独立生存,必须生活在其他生物的细胞内,一旦离开活细胞壳就不表现任何生命活动迹象。

病毒极易发生变异,即其核酸组成发生变化,如核苷酸的转换、颠换、插入、缺失等。病毒的这种变异性缘于其超级简单的结构,简单的以至于不稳定,核酸序列的变化导致表达出不同的变异蛋白。

病毒个体极其微小,绝大多数要在电子显微镜下才能看到。病毒的蛋白质外壳称为衣壳,遗传物质多为RNA或DNA。衣壳与核酸分子统称为核衣壳。但有一些病毒表面还包裹着类似细胞膜的胞膜和刺突结构,与衣壳共同决定病毒的特异性。

(二)病毒分类

病毒不仅分为植物病毒,动物病毒和细菌病毒。从结构上还分为单链RNA病毒、双链RNA病毒、单链DNA病毒和双链DNA病毒。

病毒的生命过程大致分为吸附、注入(遗传物质)、合成(逆转录/整合入宿主细胞DNA)、装配(利用宿主细胞转录RNA,翻译蛋白质再组装)、释放五个步骤。病毒会拉近细胞间距离,易使细胞相融形成多核细胞,进而裂解。

二、病毒感染

病毒感染是指病毒通过多种途径侵入机体,并在易感的宿主细胞中增殖的过程。人类病毒是指能感染人体或对人有致病作用的病毒。病毒感染的实质是病毒与机体、病毒与易感细胞相互作用的过程。病毒感染常因病毒种类、机体状态不同产生轻重不一的损伤或病毒性疾病。病毒致病是由侵入宿主、感染细胞开始的,致病作用表现在人整体和细胞两个方面。

(一)病毒感染类型

机体感染病毒后,可表现出不同的临床类型。依据有无症状,可分为显性感染和隐性感染;依据病毒滞留时间及症状持续时间长短,又可分为急性感染和持续性感染。

1、隐性感染

由于侵入机体的病毒数量较少、毒力较弱或机体的抵抗力较强,病毒在宿主细胞内增殖,但机体不出现明显的临床症状,称为隐性感染。隐性感染可使机体获得对该病毒的特异性免疫,保护机体免受该病毒的再次感染。隐性感染虽不出现临床症状,但病毒仍在体内增殖并向外界传播病毒,成为重要的传染源。

2.显性感染

由于侵入机体的病毒数量较多、毒力较强或是机体的抵抗力较弱,病毒在宿主细胞内大量增殖,出现明显的临床症状,称为显性感染。显性感染根据感染持续时间长短,分为急性感染和持续性感染。

1)急性感染:病毒侵入机体后,其潜伏期短、发病急、病程数日至数周,病后常可获得特异性免疫力,机体可通过自身的免疫机制把病毒完全清除出体外,如甲型肝炎病毒。

2)持续性感染:病毒侵入机体后,在体内持续存在数月、数年,甚至数十年,机体可出现临床症状,也可不出现临床症状而长期带有病毒,成为重要的传染源。持续感染按病程、致病机制的不同,可分为三种。

①慢性感染:病毒侵入机体后,长期存在于血液或组织中,机体可出现症状,也可不出现症状。在整个病程病毒均可被查出,如乙型肝炎病毒引起的慢性肝炎。

②潜伏感染:原发感染后,病毒基因潜伏在机体一定的组织或细胞中,但不复制增殖出具有感染性的病毒,此时机体既没有临床症状,也不会向体外排出病毒。在某些条件下病毒可被激活而急性发作,并可检测出病毒,如单纯疱疹病毒。

③慢发病毒感染:经显性或隐性感染后,病毒长时间潜伏在机体内,潜伏期可长达数月至数年,此时机体一般无症状,一般也检测不出病毒。一旦发病,则呈亚急性进行性加重直至死亡,如人类免疫缺陷病毒的感染。

致病机制

1、病毒对宿主细胞的直接作用

不同种类的病毒与宿主细胞相互作用,可表现出不同的形式。除进入非容纳细胞后产生顿挫感染而终止感染外,还可表现为溶细胞感染、稳定状态感染、细胞凋亡、细胞增殖和转化、病毒基因的整合以及包涵体的形成等。

2.病毒感染的免疫病理作用

免疫病理导致的组织损伤在病毒感染中常见。诱发免疫病理反应的抗原,除病毒外还有因病毒感染而出现的自身抗原。此外,有些病毒可以直接侵犯免疫细胞,破坏其免疫功能。

(三)病毒感染防治

目前对大多数病毒感染缺乏特效药物治疗,因此进行人工免疫是预防病毒感染最有效的手段。

三、细胞自噬

细胞自噬(autophagy)一词来自希腊单词auto-,意思是“自己的”,以及phagein,意思是“吃”。所以,细胞自噬的意思就是“吃掉自己”。

细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后,送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用。

虽然人们早就知道自噬存在,但是只有在大隅良典的精巧实验之后,人们才意识到它的机制,懂得了它的重要性。诺贝尔生理学或医学奖表彰的就是大隅良典发现并阐释了细胞自噬的机理,而细胞自噬过程是细胞成分降解和回收利用的基础。

细胞自噬概念最早提出于20世纪60年代,当时研究者们首次观察到,细胞会胞内成分包裹在膜中形成囊状结构,并运输到一个负责回收利用的小隔间(名叫“溶酶体”)里,从而降解这些成分。研究这种现象困难重重,人们对其一直所知甚少,直到20世纪90年代早期,大隅良典做了一系列精妙的实验。在实验中,他利用面包酵母定位了细胞自噬的关键基因。之后,他进一步阐释了酵母细胞自噬背后的机理,并证明人类细胞也遵循类似的巧妙机制。

大隅良典的发现是人类理解细胞如何循环利用自身物质的典范。他的发现为理解诸多生化过程—例如适应饥饿以及对感染的免疫应答—中细胞自噬的重要性打开了一扇窗。细胞自噬基因突变会导致疾病,在严重的疾病包括癌症以及神经系统疾病中都包含了细胞自噬过程。

由于大隅良典和紧随他步伐的研究者的工作,我们现在知道细胞自噬控制着许多重要的生理功能,涉及到细胞部件的降解和回收利用。细胞自噬能快速提供燃料供应能量,或者提供材料来更新细胞部件,因此在细胞面对饥饿和其它种类的应激时,它发挥着不可或缺的作用。在遭受感染之后,细胞自噬能消灭入侵细胞内细菌活病毒。自噬对胚胎发育和细胞分化也有贡献。细胞还能利用自噬来消灭受损的蛋白质和细胞器,这个自检过程对于抵抗衰老带来的负面影响有举足轻重的意义。

(一)细胞自噬的形式

细胞自噬主要有三种形式:微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬(CMA)。

1、微自噬

(1)定义:细胞微自噬是指溶酶体或者液泡内膜直接内陷底物包裹并降解的过程。

(2)作用时间:细胞微自噬多在种子成熟时储藏蛋白的沉积或萌发时储存蛋白的降解中起作用。

2、巨自噬

(1)定义:细胞巨自噬是指在自噬过程中,底物蛋白被一种双层膜的结构(粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜)包裹后形成直径约400~900纳米大小的自噬小泡,接着自噬小泡的外膜与溶酶体膜或者液泡膜融合,释放包裹底物蛋白的泡状结构到溶酶体或者液泡中,并最终在一系列水解酶的作用下将其降解,我们将这种进入溶酶体或者液泡腔中的泡状结构称为自噬小体。

(2)作用时间:细胞巨自噬发生在营养缺乏条件下培养的细胞、植物的免疫反应、叶片衰老及环境胁迫应答。

3、介导自噬

在动物细胞衰老反应过程中,往往发生分子伴侣介导的自噬过程,保存必须的组成细胞结构的蛋白和其他材料。

(二)细胞自噬的诱因、过程和机制

1、细胞自噬的诱因

正常情况下,细胞保持较低水平的自噬以维持内环境稳定。当某些应激条件出现时,如病毒感染,自噬水平可能会迅速升高以清除或抑制病毒增殖,从而度过生存“危机"。最初认为自噬发生是营养缺乏所致,因此被看作是细胞能量和代谢的感受器。然而,大量研究表明许多因素皆可诱发自噬:

(1)细胞损伤信号,如活性氧(ROS)、神经酰胺、线粒体去极化和内质网应激等;

(2)病原体侵染信号,如模式识别受体的激活和细胞因子的产生等。

2、细胞自噬的过程

细胞自噬发生的过程可分为4个阶段:

(1)起始:胞浆中形成一杯状的双层分隔膜,然后向两边延伸成扁平“碗”状,称为自噬前体或自噬泡;

(2)延伸:自噬前体把待降解的胞浆成分收入“碗”中,不断弯曲成密闭的球状,称为自噬体;

(3)成熟:自噬体形成后,可与细胞内吞泡、吞饮泡和内体融合,形成自噬内涵体;

(4)降解:自噬体或自噬内涵体与细胞中的溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解底物同时释放物质和能量供细胞循环利用。

3、细胞自噬机制

一系列自噬相关基因(Atg)构成了自噬过程的调控网络。第一个自噬基因(Atg1)在酵母中发现,其在哺乳动物中的同源蛋白为ULK1,目前已经有三十多个Atg被克隆,这些基因在自噬过程中发挥着各自的作用。其中Atg1、Atg13和Atg17构成了ULK1复合物,是自噬发生的正调控因子。正常情况下,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白与ULK1复合物结合,抑制自噬。在饥饿或其他诱发因子存在时,mTORC1从该复合物上脱离,启动自噬发生。 Beclinl (与酵母Atg6同源)复合物由膜泡分拣查白34 (VPS34)p150、Belin 1 (VPS30)ATG14组成,是1型磷脂酰肌醇3酶(PI3K)复合体的支架白。ULK复合物和P13K复合物靶向募集到自噬体起始部位后,分别产生自噬体特异性的磷脂酰肌醇3-磷酸(PtdIns(3)P)池,招募Atg10、Atg7、Atg3、Atg8/LC3、Atg4和Atg12-Atg5-Atgl6L1等蛋白参与自噬体膜的延伸和成熟。最后,自噬体膜的受体多聚泛结合蛋白p62/SQSTMI (p62)可与微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白结合在一起成为自噬降解的底物,进而清除线粒体、内质网等受损细胞器,释放出能量营养物质供细胞再利用。

加州大学圣地亚哥分校的管坤良教授领导的一支研究团队揭示了调控细胞自噬的一个关键分子机制,研究人员发现,AMPK酶,不仅参与了细胞的传感和能量调控,而且在细胞自噬酶作用方面,也扮演了重要角色。细胞自噬是细胞在恶劣条件下确保其生存的基本应激反应。

研究人员发现,AMPK能以不同的方式,调控一种称为Vps34激酶家族不同的复合物,一些Vps34酶参与了正常细胞的囊泡运输—细胞中一种重要的分子运输,还有一些Vps34复合物则参与了细胞自噬。管教授与其同事们发现,AMPK能抑制那些未参与细胞自噬的酶,而激活参与细胞自噬的Vps34酶。

细胞自噬的意义及未来应用

细胞自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样,是十分重要的生物学现象,参与生物的发育、生长等多种过程。细胞自噬的异常导致癌细胞的出现。

人们知道自噬机制的存在已经50年,但是它在生理学和医学中的核心重要性只有在大隅良典20世纪90年代开拓性的研究之后才被人们广泛意识到。

遭到扰乱的细胞自噬过程与帕金森氏病、II型糖尿病和其他许多疾病都有所关联。自噬基因的突变可以导致遗传病,自噬机制受到扰乱还与癌症有关。目前人们正在进行紧张的研究以开发药物,能够在各种疾病中影响细胞自噬机制。

细胞自噬是一个自然发生的过程,在这个过程中,过量或异常的蛋白质或生物大分子包括细胞器如线粒体、病毒和其他病原体等物质会被细胞分解,可以作为体内环境的能量或作为材料进行自我循环和回收。一旦细胞的自噬异常,这些物质就会积累,进而导致一系列疾病。通过对细胞自噬系统的各个点进行干预,可以改善或清除不需要的蛋白、细胞器以及入侵病原体的过程,基于细胞自噬的机理,开发出能通过刺激细胞自噬来阻止或逆转一些严重疾病(如病毒感染、癌症、溶酶体储存障碍相关疾病、肝脏和肌肉疾病、炎症性疾病、神经退行性疾病等)的新药。

四、细胞自噬与吞噬

吞噬作用是细胞表面模式识别受体(PRsa)识别并结合微生物表面病原相关分子模式(PAMPs)后,将胞外病原体内吞形成吞噬

泡,与细胞中的内体融合形成成熟的吞噬泡,最终与溶酶体融合消化降解吞入的病原体的过程。当病毒突破机体屏障结构进入皮肤或皮下组织,接触到周围存在的巨噬细胞,即被吞噬清除。值得注意的是,有研究发现除了对病毒实体的直接吞噬清除,吞噬细胞也可以通过吞噬凋亡细胞,即病毒感染后诱导凋亡的宿主细胞,来限制病毒的传播减轻病毒感染的病理损伤。

近年来,不少学者发现自噬与吞噬之间存在协同作用且共享某些元件,两者在形成自噬体和吞噬体以及成熟方面高度相似。有实验显示,在相关TLR被激活后,含有内容物的单层膜吞噬泡可以迅速招募微管相关蛋白轻链3(LC3),然后与溶酶体融合,加速吞噬细胞对被吞噬病原体的杀灭作用,此过程称为LC3相关吞噬作用(LAP) 。值得注意的是, LC3是自噬过程重要的标志蛋白,自噬的启动有赖于LC3的脱乙酰化,且LC3在自噬体膜的延伸和成熟中同样发挥着关键作用。 LAP与自噬均可被TLR激活,参与机体的固有免疫。研究发现LC3蛋白的其中一个亚型LC3C起到关键作用,实验观察到海拉(HeLa)细胞中LC3C是Vpu介导清除位于病毒出芽位点的细胞限制因子骨髓基质抗原2(BST2)的关键分子,Vpu利用LC3C需要BST2的表达,与LC3C特异性结合,再与BST2结合,类似于激活LAP途径来促进BST2向胞内转运,减少对病毒释放的干扰。缺乏LC3C会导致成熟的病毒滞留在细胞内单层膜的囊泡内,影响病毒的释放。这揭示了病毒面对细胞防御措施时往往可以利用自噬逃离免疫,进一步探究自噬途径在病毒免疫中发挥的作用将会是展开抗病毒免疫新局面的重要手段。

五、细胞自噬与抗原提呈

抗原提呈是机体从天然固有免疫向适应性免疫转变的过渡阶段,也是机体对病原体进行免疫应答的起始阶段,在此过程中抗原提呈细胞和人类主要组织相容性复合体(MHC) 负起了非常重要的任务。病毒因其寄生的特点,既可以作为外源性抗原,也可以作为内源性抗原,分别激活经典的MHC I或MHC II途径,并且涉及交叉提呈途径,因此了解细胞自噬对抗原提呈的影响对于认识细胞自噬抗病毒作用具有重要意义。

启动针对某些病毒的抗病毒免疫可能更多地依赖于被感染的抗原提呈细胞利用内源性抗原通过MHC I途径激活。研究发现,在人类抗原提呈细胞中,用Atg8/LC3修饰的吞噬体显示成熟延迟,可以延长抗原呈递时间,吞噬体暂时充当抗原的储存仓库,以维持MHC II类抗原提呈途径的持续活动。

相较于自噬对于MHC II经典途径明确的促进作用,其在MHC I途径中的表现恰恰相反。有研究明确指出自噬机制支持MHC II限制性抗原呈,但损害MHC I限制性抗原呈递。研究人员通过对比Atg5或Atg7缺陷的小鼠与野生小鼠在MHC I类分子表达方面的表,发现自噬机制的缺陷会提升其表达,且在体内外对抗病毒感染的实验中Atg5缺陷的树突状细胞(DC)均能更有效地刺激CD8+T细胞。之后也有实验发现调控自噬启动的重要蛋白Vps34缺陷的DC对于卵清蛋白、流感病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的MHC I类抗原提呈能力均有明显的增强作用。

DC作为专职抗原提呈的免疫细胞,在病毒抗原的交叉提呈中有着重要意义,有研究显示自噬缺陷的DC在交叉提呈可溶性抗原方面(如卵清蛋白)效率下降,但在表面受体靶向抗原或凋亡细胞相关抗原的交叉表达上没有缺陷。然而,也有实验显示缺乏Vps34的DC在与凋亡细胞相关抗原的交叉表达上存在缺陷,而其他抗原表现正常交叉 。此外,单纯性疱疹病毒1(HSVI)1CP34.5可以对抗感染DC的自噬降解,导致溶酶体降解减少,从而损害对HSVI的抗原处理和MHC I表达,猜测自噬可能是作为一种向免疫系统报告病原体入侵的补偿手段。利用这些研究成果或许可以改进自噬在疫苗制备时提纯抗原方面的技术。

六、细胞自噬与淋巴细胞

逃离了固有免疫系统非特异性清除的病毒持续复制,最终会被专职抗原提呈细胞捕获并激活特异性免疫,启动由淋巴细胞主导的体液免疫和细胞免疫。

细胞自噬与T淋巴细胞

通过T淋巴细胞清除异物,尤其是病毒等胞内微生物感染的宿主细胞,是机体应对病毒感染的重要手段。初始T淋巴细胞成熟后分化为功能不同的T细胞,包括细胞毒性T细胞、辅助型T细胞和记忆型T细胞,已经有研究证实自噬对于维护初始T细胞的稳态至关重要,且对于正在发挥免疫功能的T细胞起到保护作用,自噬在各类T细胞中发挥的作用也被重点关注。

效应型T细胞,因其表面主要表达CD8+因子,也称作CD8+T细胞,由其介导的细胞毒性作用对于清除病毒感染细胞尤其重要。有学者通过监测细胞内的自噬通量,观察不同发育阶段中的CD8+T细胞在特异性敲除相关自嘘基因后对抗病毒感染的表现,并发现自噬对于正常效应型CD8+T细胞的克隆扩增并不是必需的,但对其通过收缩期形成记忆型T细胞有显著影响,表明有缺陷的自噬通路损害了CD8+T细胞记忆池的形成。同样的结果也出现在其他一些相关的实验中,发现效应型CD8+T细胞不仅需要自噬来抑制细胞死亡和维持生存以应对病毒感染,且在对抗流感病毒感染的反应中,Atg5缺陷CD8+T细胞达到效应反应峰值的能力下降,在效应阶段无法维持细胞活力,同时也影响了记忆T细胞的存活。

细胞免疫和体液免疫的正常过程都需要辅助型T细胞的参与,其也被称作CD4+T细胞,自噬除了利用清除受损细胞器的功能来保证CD4+T细胞在发育过程中的稳态,还可以帮助其对抗病毒的侵袭。CD4+T细胞是HIV主要的感染细胞,研究表明在HIV病毒攻击后早期自噬选择性地降低了HIV-1转录活化因子(Tat),起到了一定的抵抗作用,但很快就被病毒所抑制。

细胞自噬与B淋巴细胞

在体液免疫中,浆细胞产生的抗体可以中和病毒,阻止其结合宿主细胞的受体,如果抗体能在病原体复制之前产生,那么体液免疫就能阻止感染的临床表现,这也是注射疫苗的主要目的。

细胞自噬在体液免疫,尤其是在B细胞中发挥的作用已研究了很长时间。首先,为了维持B淋巴细胞在淋巴器官中的正常数量,B细胞需要基础水平的自噬。其次,当B细胞接受抗原和辅助型T细胞的双重刺激信号,开始分化为浆细胞以及记忆B细胞时,自噬在其中也起到了重要作用。分化过程中缺乏自噬的B细胞不能够很好活化,且抗体分泌受损,无法形成有效的体液免疫, Kara等和Florent等的实验证实了这一点,且两者都注意到这是由于自噬可能参与了B细胞抗原受体(BCR)的转运,影响B细胞的极化。

对于浆细胞而言,自噬更多地满足了维持细胞稳态和长期体液免疫的双重需要。实验发现自噬缺陷小鼠体内的浆细胞分泌免疫球蛋白的能力明显升高,但与正常小鼠相比,长寿的具有抗原特异性的骨髓浆细胞较少,这证实了免疫球蛋白的合成和生存能力之间具有一种自噬依赖性的保护平衡作用。

在体液免疫中,拥有长寿的记忆B细胞可以更加快速准确的应对病毒的二次感染,有研究表明自噬对于记忆B细胞的初始生成也许不是至关重要的,但是对于它们的长期生存是必需的,在细胞自噬活跃的记忆B细胞维持阶段,刺激自噬可能更有效地改善记忆B细胞的功能。这一发现可能在制备疫苗以及延长疫苗的效应期方面展现了一个新的突破口。

综上所述,细胞自噬从被发现至今,在病毒免疫过程中的多种促进或者抑制作用发现了其在抗病毒治疗和预防方面的巨大潜力。有学者已经想到将抗原同自噬相关蛋白结合直接导向自噬通路,用以提高免疫应答水平;另外自噬可以延长记忆型免疫细胞的存活寿命,相关实验只是发现了这些现象,但具体的机制问题仍未得到解决。除却自噬本身可以维持稳态保证细胞存活以外,与其他细胞活动过程的合作或者拮抗是否也可以提高记忆细胞的寿命?如果解决了这类机制问题,对于提高某些疫苗的长效期方面将会是重大的突破。

七、细胞自噬与抗病毒免疫作用

病毒在宿主内的感染和复制能引起应激反应,而作为应激反应的一部分,细胞自噬过程能被激活,直接吞噬、降解入侵的病毒,同时通过MHC I、MHC II分子递呈病毒抗原,但部分病毒也可能利用自噬机制实现免疫逃逸,甚至加速自身在宿主细胞内的复制。病毒感染和细胞自噬间存在复杂且多向化的相互作用。

病毒诱导细胞自噬的激活

1、病毒蛋白诱导细胞自噬

病毒感染宿主后会产生大量病毒强白、DNA、RNA等组分参与诱导自赚的产生。目前对病毒诱导细胞自噬的确切作用尚存在争议,普遍认为从宿主细胞的生存角度来说,自噬激活在感染早期主要在于清除人侵的病毒;而在感染后期,病毒可能进化出某种机制反而利用自噬逃避宿主免疫应答。

2、病毒受体诱导的细胞自噬

膜表而受体和TLRs、NOD样受体等不同的病原体识别受体(PRRs)家族,ATP、ROS、错误折叠蛋白等损伤相关分子模式(DAMPs)均被证实能在病毒感染时参与细胞自噬的诱导。但目前对于不同病毒通过受体配体相互作用激活自噬是否具有某些共同的分子机制尚无定论。

3、细胞应激诱导的自噬

许多病毒感染可引起内质网应激(ERS)诱导自噬发生。研究发现,ERS诱导细胞自噬发生的分子机制可能与引起胞Ca离子增加,从而活化多种自噬相关激酶与蛋白酶相关。然而,最近有报道指出,细胞处于轻度ERS状态时,可以通过UPR诱导自噬发生以清除受损蛋白质促使细胞存活;而持久的ERS可过度激活自噬引起自噬性细胞死亡。因此,充分了解ERS诱导的细胞自噬发生机制与相关途径,可以为病毒感染性疾病及其他疾病如肿瘤等的治疗提供新的靶点。

细胞自噬与抗病毒固有免疫

1、自噬与PRR相互调节

自噬由于能直接存噬、降解病原体而被认为是机体免疫屏障之一。模式识别受体(PRR)是一类主要表达于固有免疫表面、非克隆性分布、可识别一种或多种病原体相关分子模式(PAMP)的识别的分子,其与病原生物表面的相互识别和作用是启动固有免疫应答的关键,其中位于巨噬细胞或DC细胞膜上的激TLR被相应的病毒或病毒产物激活后可以诱导自噬直接清除细胞内的病毒。

反之,自噬也可以调节PRRs,并通过协助PRRs对病毒PAMPs的识别增强固有免疫,。由此推断,如果我们将自噬作用引入某些抗病毒药物及疫苗的应用,应该可以协助清除病毒、增强机体固有免疫应答。

2、细胞自噬与炎症细胞因子相互调节

先天免疫系统通过分泌I型干扰素(IFN)和细胞因子等炎症介质促进炎症反应抵御微生物感染,而这些炎症细胞因子同时也参与自噬的调节。研究证实活化的NK-κB能通过激活mTOR途径抑制自噬,而当NK-κB被阻断时,TNFα可以通过增加Beclin 1的表达激活自噬。 IFN-γ能通过p47免疫相关GTPase(IRG)家族成员诱导自噬。反过来,自噬又参与IRG因子对细胞内病毒的控制和清除过程,如吞噬体的酸化成熟、直接摧毁吞噬泡膜等。相对于IFN-γ,TNFα等能诱导自噬的Th1型细胞因子,Takeshi 等用IL-4、IL-13等Th2型细胞因子预处理巨噬细胞,发现细胞自噬被抑制,进一步研究发现,当IL-4、IL--13分别与受体结合,不仅引起信号转换器和转录因子6活化剂(SATA-6)通路的活化,还能通过胰岛素受体底物-1(IRS-1)IRS2传递信,这些信号激活P13K/Akt/mTOR通路,并为IL-4、IL-13抑制自噬提供基础。总之,Th1/Th2细胞因子分别通过不 同的途径激活/抑制自噬,而自噬又是Th1/Th2极化的效应器,也解释了为什么在控制病毒感染时Th1细胞能起主要保护作用。近年来研究发现自噬介导的DNA疫苗诱导Th1型细胞因子水平显著升高,Th2型细胞因子水平无显著变化而不是下降。为此,只有进一步探索自噬调节炎症细胞因子的作用机制才能明确两者之间的关系,从而利用自噬增强机体抗病毒免疫应答。

细胞自噬与抗病毒适应性免疫

1、自噬协助加工和递呈病毒抗原给MHC 1

自噬能协助专职抗原提呈细胞(APC)将病毒抗原递呈给T细胞,同时也是启动有效抗病毒适应性免疫应答所必需的。病毒蛋白通常在自噬体囊泡内被蛋白酶水解,形成的抗原肽装载到内质网MHC分子上进行抗原呈递。病毒感染过程中,抗原蛋白主要由经典的MHC I分子表达途径处理。抑制经IFN-γ处理的B16鼠黑色素瘤细胞自噬活性,可以减少其表面MHC1分子的表达以及CD8+T细胞对肿瘤细胞的溶解。而这些经IFN-γ处理的肿瘤细胞的MHC1分子是蛋白酶体依赖的,也提示自噬和经典MHIC1分子递呈之间可能存在联系。用雷的需帕霉素或饥饿诱导树突细胞的自噬活性,可以增强CD8+T细胞对靶细胞的杀伤作用,而这种效应依赖靶细胞Atg5的表达,提示经典的MHC1抗原递呈途经需要靶细胞自噬的参与。最近研究证实自噬机制通过促进DC表面MHC1分了水平表达,在A型流感病毒体内感染过程中增加MHC1类分子递呈抗原给CD8+T细胞。

2、自噬协助加工和递呈病毒抗原给MHC II

MHC II类分子可以促进CD4+T细胞对外源性病原体和蛋白抗原的识别及免疫应答。对多种APC的MHC II类配体进行测序发现,有10%~30%的配体来源于细胞质或核抗原,而自噬能够将胞浆成分转运到溶酶体内水解,有助于细胞内抗原的处理供MHCII分子递呈,提示自噬等替代途径可能参与将配体传递给MHC II类分子。病原体被吞噬并在自噬溶酶体内降解成多肽最终装载到MHC II分子上,形成的多肽MHC复合物(pMHC)被运送到细胞表面呈递给CD4+T细胞,从而证实自噬能促进MHC II将病原体源性多肽呈递给CD4+T细胞。特异性自噬阻断药物(3-MA和wortmannin)已被证明可降低DC对内源性合成黏液素1蛋白(MUC1)来源MHC II特异性抗原肽的递呈能力。Atg5缺失则削弱宿主CD4+T细胞和MHC II特异性胸腺T细胞的抗病毒应答。功能试验也证实流感病毒抗原与LC3B结合靶向到自噬小体内,使MHC II递呈至特异性CD4+T细胞的能力放大20倍,证明了自噬处理抗原对MHC II类分子呈递的重要性。

3、自噬促进抗原的交叉递呈

在树突状细胞和巨噬细胞中,有一种被称为交叉递呈的替代途径,可以增加MHC I对外源性抗原和吞噬物质中抗原表位的递呈,促进CD8+T细胞对病原体的应答。自噬直接影响MHC I经典途径递呈抗原的证据有限,但确有研究表明,诱导自噬还能促进MHC I的交叉递呈,通过干扰Atg12或Atg5的表达或使用药物抑制DC自噬,均能干扰多种内源性和外源性蛋白抗原的MHC I类表达。分别用雷帕霉素/3-MA预处理宿主细胞,随后与DC共同孵育可以发现诱导的抗原特异性CD8+T细胞免疫应答增强/减弱。进一步分析证实Beclin-1/Atg12宿主细胞的抗原特异性交叉递呈反应显著降低。自噬促进抗原交叉递呈的具体机制尚未完全明确,可能与自噬小体作为抗原载体刺激DC对抗原的摄取、加工及递呈有关。

细胞自噬与免疫细胞的分化及维持

近年来,大量研究强调了白噬在淋巴细胞存活和记忆方面至关重要的作用。外周初始T细胞的存活依赖于T细胞受体(TCR)基质细胞,IL-7信号的相互作用,而后者与Atg3依赖的自噬过程密不可分。当初始T细胞存在Atg3缺陷时,IL-7对其短期存活并无影响,然而,在24天的长期培养中,Atg3缺失的CD4+和CD8+T细胞死亡率明显高于自噬活性正常的T细胞,其中CD8+T细胞比CD4+T细胞数量减少更显著,提示自噬在某些效应细胞亚型中起更重要的作用,可能源于自噬在这些胸腺细胞的分化中起支持和驱动的作用。此外,也可能仅仅因为与CD4+T细胞相比CD8+T细胞基础自噬水平较高,更依赖于自噬维持新陈代谢环境。

自噬在T细胞活化的早期阶段并不是必需的,同时成熟T

细胞自缺陷对其短期功能影响并不大,但对dl.ckere Atg5f/f

1小鼠的研究表明,自噬对短期CD4+T细胞的活化是必不可少

的,自噬还参与CD4+、CD8+记忆细胞的维持。自噬能通过噬脂作用协助脂类分解代谢,从而维持CD4+记忆性T细胞、B细胞和CD8+T细胞的存活,而自噬缺陷的情况下会引起代谢产物生成减少,从而引起记忆性T细胞的存活选择性受损,这一点可以通过自噬缺陷时脂质吞噬受限,导致CD4+T细胞内中性脂质的积累得到证实。T细胞记忆池之前已

经被证实是由AKT/PI3K、AMPK以及mTOR信号通路所控

制的,这些同时也是自噬的调节通路之一,提示T细胞记忆反

应能被mTOR抑制剂雷帕霉素改善。由此可见,病毒感染诱导的自噬能促进淋巴细胞和免疫记忆性细胞的分化和维持,尽管具体作用机制目前尚不明确,但这一发现为解决现有某些病毒疫苗长效保护性不足问题提供了新的思路。

细胞自噬在抗病毒免疫中的应用

近年来,关于自噬在抗肿瘤领域作用的研究已取得一定进

展,成功研制出多种药物如雷帕霉素等通过对自噬通路的调节

抑制肿瘤细胞的存活、增殖。利用自噬抵御病毒入侵的研究证

实,HIV-1 Nef蛋白通过与正调节自噬的关键因子Beclim-1相互作用抑制自噬,而这种相互作用由Beclirn-1上一段18个氨基酸残基的肽段介导,将HIV的Tat蛋白与该肽段融合后导入多种细胞,可以成功诱导细胞自噬。对尼罗河病毒(WNV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)感染小鼠的研究也同样观察到该自噬肽具有显著抗病毒作用,且在体内外实验中未见明显毒副作用。这种新型抗病毒策略能通过对自噬的调节促进宿主清除入侵的病毒,是临床抗病毒治疗的新靶点。近年来,科研工作者尝试将自噬介导作用引入疫苗的研发中,通过构建自噬靶向DNA疫苗LC3-LpqH。将LC3B与鸡白血病病毒gp85抗原融合后免疫鸡,均证实能将病原体抗原靶向于自噬途径,并显著增加DNA疫苗诱导的Th1型免疫应答。虽然研究者对自噬靶向DNA疫苗诱导免疫效应的研究还比较局限,对免疫记忆尚未做阐述,且其中自噬作用的机制亦尚未涉及,但对细胞自噬在机体抗病原体保护性免疫过程中的重要作用给予我们重要启示,同时也为病毒DNA疫苗研发提供了新思路。

八、细胞自噬与病毒感染

病毒作为一种专性细胞内寄生物,病毒的生存和复制主要取决于如何利用宿主资源。近年来,大量关于自噬和病毒感染的研究被报道。细胞自噬和病毒感染之间的关系已在20多种DNA和RNA病毒属的几十种病毒中被广泛研究。这些研究有助于认识自噬在宿主免疫、病毒生命周期和发病机制中的作用。由于自噬在不同的细胞功能中具有重要作用,许多病毒利用自噬机制使之有利于自身的生存和复制;另一方面,自噬途径已成为抗病毒免疫的重要效应器。病毒在自噬的长期选择压力下与宿主共进化,形成了多种策略以逃避自噬,包括选择自噬捕获、抑制自噬起始和自噬体成熟。因此,自噬的调控可能是一种新的病毒性疾病的治疗策略。

病毒对细胞自噬的调控

1、病毒利用细胞自噬

自噬可能会被病毒利用,为病毒服务。一些病毒在进化过程中获得了利用自噬的能力,某些病毒甚至可以通过降低宿主的应激反应或者阻断自噬流,调控自噬机制以利于自身的复制周期。研究证实病毒不仅可以利用自噬体作为病毒复制的平台,甚至可以利用自噬完成病毒颗粒的组装和释放。

自噬对于病原体的限制性感染有着至关重要的作用。然而,一些微生物,如冠状病毒、HIV以及巨细胞病毒等形成了逃避杀微生物系统的机制。这些微生物的逃避机制都与它们能够抑制自噬溶酶体的融合,逃避细胞质中吞噬泡以及抗溶酶体降解有关。

2、病毒诱导细胞自噬机制

(1)病毒蛋白诱导细胞自噬

病毒在感染过程中会产生大量的病毒组分,如DNA、RNA和病毒蛋白等,病毒蛋白在诱导自噬产生中具有重要作用,病毒感染或病毒相关蛋白的表达诱导自噬泡的形成,利于病毒的复制。上调细胞自噬水平可增强病毒的复制能力,下调自噬水平可降低病毒载量。

(2)病毒与受体结合诱导细胞自噬

病毒可通过先天性免疫受体诱导自噬。病毒的病原相关分子模式PAMP可被细胞内的模式识别受体(PR),如RIG-I样受体(RLR) NOD样受体(TLR)Toll受体(TLR)识别并结合,诱导的自噬影响PRR信号通路,负调控炎症反应,利于病毒的复制。

病毒还可与细胞表面受体结合诱导自噬,影响病毒复制。多种病毒可以与普遍存在于细胞表面受体CD46结合,从而诱导自噬。

(3)病毒感染后的细胞应激诱导自噬

病毒感染细胞引发细胞应激,如营养缺乏、缺氧、ER应激和活性氯自由甚(ROS)的产生等,从而诱导细胞自噬。有些病毒感染细胞后导致ROS上升,刺激细胞产生自噬。

3、病毒阻断自噬体的形成

病毒在不断的进化过程中,已经进化出多种途径阻断自噬。

细胞自噬抗病毒机制

细胞自噬过程的进化,不仅是为了维持细胞和组织内环境平衡,而且可以保护细胞免受病原微生物的侵害,这种保护机制是通过将胞质内的“货物”成分转运到内吞酶体系统中,从而降低胞质中“货物”成分含量,协调宿主针对包括病毒在内的不同病原微生物的免疫应答。自噬可以将胞质中的病毒转运到溶酶体中,降解病毒,也可以将病毒核酸转运至胞内感受器上激活天然免疫杀灭病毒,还可以将病毒抗原递呈给MHC II类分子激活适应性免疫抵抗病毒,从而达到抗病毒的目的。然而,细胞自噬的这些机制也可能被病毒利用,为其自生服务,躲避由细胞自噬介导的抗病毒机制。

自噬是免疫系统中一个完整的部分,对于病毒来说,自噬是一把双刃剑,既可以促进病毒的增殖,又具有抗病毒效应。自噬过程中有多种自噬蛋白的参与,按照参与自噬形成的顺序,主要包括以下五种:ATG1/ULK I蛋白激酶复合体、Vps34-ATG6/Beclin1与III型PI3K 复合体、ATG9/mATG9、ATG5-ATG12-ATG16和 ATG8/LC3连接系统。自噬蛋白参与病毒蛋白的相互作用,影响病毒复制。

细胞自噬与病毒复制

自噬在抗病毒反应中发挥着重要的作用,但同时病毒也进化出一些相应的策略来对抗自噬,使得病毒本身能在宿主体内潜伏和增殖,完成自己的生命周期。研究表明,各种病毒可以对自噬的不同阶段加以破坏,对抗自噬的抗病毒作用。人疱疹病毒

(HV)可通过抑制自噬的上游激活信号通路、干扰自噬的调节机制以及影响自噬相关蛋白的功能来破坏自噬,降低自噬对该病毒的清除作用。一些病毒可以利用自噬来使病毒本身在宿主内更好的存活,丙肝病毒(HCV)和登革热病毒(DEV)都可以诱发未折叠蛋白反应来激活自噬,以此来逃逸天然免疫反应。

除了破坏自噬的发生过程,研究证实一些病毒还可以利用自噬帮助自身复制,把自噬体作为自身复制的平台,还可以通过自噬的过程完成病毒颗粒的组装和释放。最早发现自噬对病毒复制的促进作用基于对脊髓灰质炎病毒的研究,随后在对多种病毒的研究中得到证实。有研究表明HCV可以诱发未折叠蛋白反应,激活自噬的信号通路,进而促进HCV在人体肝细胞中的复制。用RNAi干扰感染新城疫病毒(NDV)的人官颈癌细胞(Hela)和人胚肾细胞(HEK)使自噬相关基因Atgs5和Beclin-1基因沉默,发现病毒的滴度具有显著性的下降。利用mTOR免疫抑制剂雷帕霉素处理鲤春病毒(SVCV)感染的鲤上皮瘤细胞(EPC),增加诱导自噬,发现病毒的增殖得到了促进,而用3MA处理抑制自噬发现可以抑制病毒的增殖,且通过对自噬特异性基因微管相关蛋白I轻链(LC3)基因和Beclin-1基因干扰实验证实了细胞自噬促进了SVCV的复制及病毒颗粒的释放。用3MA对肠道病毒71型(EV71)诱导的自噬进行抑制,发现小鼠的病症得到缓解,且小鼠大脑组织中的病毒载量降低。研究证明寨卡病毒(ZKV)感染人脐静脉内皮细胞(HLUVEC)会触发细胞自噬,用自噬体形成抑制剂等处理,可显著降低病毒产生。自噬泡为一些在胞浆中复制的病毒提供了一个有利的附着场所,以便于这些病毒的增殖。在人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的早期,发现HIV的核衣壳蛋白与LC3-II具有共定位的现象,在脑心肌炎病毒(EMCV)感染后也发现了EMCV病毒的VP1蛋白、3A蛋白与LC3具有共定位的现象,这些现象说明病毒复制的复合物存在于自噬小体中。此外,某些病毒可以通过阻断自噬体与溶酶体融合,从而阻止自噬小体的破坏,以利用自噬体膜高效复制病毒本身的基因组。在人类T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)感染的研究中发现,HTLIV-I的Tax蛋白可以阻止自噬小体和溶酶体的融合,减少自噬小体的被溶酶体降解,增加自噬体的积累,从而促进HTLV-I的复制.水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染人胚肺成纤维细胞可诱导自噬,抑制自噬体与溶酶体融合,并在一定程度上抑制mTOR介导的自噬流。此外,阻断自噬流能促进VZV复制。

九、讨论

细胞自噬最初仅被认为是单纯用以维持细胞内稳态的生理过程,随着研究的深入,发现它不仅能降解老化细胞器及受损蛋白质、核酸等胞内物质以供细胞循环利用,还能对多种人类疾病的发生发展产生重要影响。关于自噬在肿瘤领域作用的研究是当前一大热点,除此之外细胞自噬还能增强机体的固有免疫和适应性免疫,进而协助宿主细胞抵御病毒感染。因此,在病毒感染过程中对宿主细胞的自噬作用进行干预,能影响病毒的复制和致病性。目前对于自噬和病毒感染关系的研究已经取得较大进展,但细胞自噬是一个复杂的、多因子参与的过程,对多种病毒感染性疾病与自噬关系的研究发现,细胞自噬在不同细胞、不同病毒感染、不同状态下有着不同的信号通路和生物功能。对于入侵机体的病毒究竟是清除还是促进其在宿主细胞内的存活增殖,不仅取决于病毒的类型,还与疾病进展的不同阶段密切相关。

感染病毒后,自噬可以帮助人体天然免疫(固有免疫)反应和适应性免疫(获得性免疫)反应来清除病毒,同时病毒也能利用自噬来促进病毒复制、成熟、组装和释放。通过对自噬与病毒感染关系的深入研究,可以将自噬作为抗病毒药物及疫苗研究的切入点,通过对自噬的调节,控制病毒感染。随着对细胞自噬与病毒感染、免疫三者之间的关系及相互作用机制研究的不断深入,这些机理将逐步明确,为开发新型抗病毒药物及疫苗,最终控制病毒感染性疾病提供研究依据。

 

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